一、培养基灭菌的目的和要求

灭菌的目的就是杀死一切微生物。在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因此所有发酵过程必须进行纯种培养。由于培养基中通常都含有营养比较丰富的物质，并且整个环境中存在大量的各种微生物，因此发酵过程很容易受到杂菌的污染，进而会产生各种不良的后果，具体包括：

①由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降;

②由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，加大了产物提取和分离的困难，造成产品收率降低或质量下降;

③杂菌的大量繁殖，会改变培养介质的pH，从而使生物反应发生异常变化;

④杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败;

⑤发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败等。

特别是在种子移植过程、扩大培养过程以及发酵前期，如果杂菌一旦侵入生产系统，就会在短期内与生产菌种争夺养料，严重影响生产菌正常生长和发酵作用，以致造成发酵异常。所以整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌操作，除了设备应严格按规定保证没有死角、没有构成染菌可能的因素外，还必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染。

二、培养基灭菌的方法

灭菌的方法有很多种，可分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌和湿热灭菌)、过滤除菌、紫外线辐射灭菌等。化学法主要是利用无机或有机化学药剂进行消毒和灭菌。在具体操作中，可以根据微生物的特点、待灭菌物品材料以及工艺要求来选择灭菌的方法。

1．加热灭菌

加热灭菌主要利用高温使菌体蛋白质变性或凝固、酶失活而达到杀菌的目的。根据加热方式不同，又可分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌主要指灼烧灭菌法和干热空气灭菌法。湿热灭菌包括高压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法、巴斯德消毒法和煮沸消毒法等。湿热灭菌时蒸汽穿透力大，蒸汽与较低温度的物体表面接触凝结为水时可释放潜热，吸收蒸汽水分的菌体蛋白易凝固。菌体蛋白的凝固温度与含水量密切相关，蛋白质含水分多者凝固温度低，如细菌、酵母菌及霉菌的营养细胞，含水量>50%，50～60℃加热10min即可使蛋白质凝固而达到杀菌目的。蛋白质含水分较少者需较高温度方可使蛋白质凝固变性，如含水较少的放线菌及霉菌孢子，蛋白质凝固温度为80～90℃，故此温度加热30min方可杀死。细菌的芽孢不仅含水量低，且含吡啶二羧酸钙，蛋白质的凝固温度在160～170℃，干热灭菌需140～160℃，维持2～3h方可将芽孢杀死;湿热灭菌需121℃维持20min。因此，一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准。

（1）干热灭菌

①灼烧灭菌法

灼烧灭菌是利用火焰直接将微生物烧死，灭菌迅速彻底，但要焚毁物体，使用范围有限。该法的使用范围：金属小用具接种前后的灭菌（如接种环、接种针、接种铲、小刀、镊子等)，试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用的污染物等的灭菌。

②干热空气灭菌法

进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用是导致微生物死亡的主要依据，该法的使用范围：常用于空的玻璃器皿(如培养皿、锥形瓶、试管、离心管、移液管等)、金属用具(如牛津杯、镊子、手术刀等)以及其他耐高温的物品（如陶瓷培养皿盖、菌种保藏用的沙土管、石蜡油、碳酸钙)等灭菌。其优点是灭菌器皿保持干燥，但带有胶皮和塑料的物品、液体及固体培养基不能用干热灭菌。

(2）湿热灭菌

①高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使得微生物死亡。高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法，一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本等都可以用此法灭菌。

②丁达尔灭菌法

丁达尔灭菌法又称间歇灭菌法，是依据芽孢在100℃的温度下较短时间内不会失去生活力而各种微生物的营养体半小时内即杀死的特点，利用芽孢萌发成营养体后耐热特性随即消失，通过反复培养和反复灭菌而达到杀死芽孢的目的。不少物质在100℃以上温度灭菌较长时间会遭到破坏，如明胶、维生素、牛乳等，采用此法灭菌效果比较理想。常压蒸汽灭菌时，用普通蒸笼即可，但手续繁琐、时间长，一般能用高压蒸汽灭菌锅的均不采用丁达尔灭菌法。

③巴斯德消毒法

巴斯德消毒法是以结核杆菌在62℃下 15min 致死为依据，利用较低温度处理牛乳、酒类等饮料，杀死其中可能存在的无芽孢的病原菌如结核杆菌、伤寒沙门菌等，而不损害饮料的营养和风味。一般采用63～66℃、30min或71℃、15min处理牛乳、饮料，然后迅速冷却，即可饮用。

④煮沸消毒法

一般煮沸15～30min，可杀死细菌的营养体，但对其芽孢往往需煮沸1~2h。如果在水中加入2%碳酸钠，可促使芽孢死亡，亦可防止金属器械生锈。

2.过滤灭菌

过滤器主要有两类：一类是绝对过滤器，过滤介质呈膜状，其滤孔比要除去的颗粒的直径小，理论上可以100%除去微生物;另一类是深层过滤器，其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大，它们由锈毛、棉花、石棉和玻璃纤维等组成。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是拦截作用，可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为其有一定的厚度，所以也可通过惯性撞击、扩散和静电吸引等作用去除出孔径小的颗粒，这些作用在空气过滤时格外重要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降，采用带许多褶皱的薄膜可以增大表面积，从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性撞击、拦截、布朗扩散、重力沉降和静电吸引等作用除菌，从理论上讲，它不可能绝对地去除所有的颗粒。

（1） 培养基的过滤除菌

对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基，无法采用高温灭菌法，但可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料，也有石棉板、烧结陶瓷、烧结金属等深层过滤材料。

(2)空气过滤除菌

绝大多数工业生产菌是好氧的，因此，在发酵过程中必须通入无菌空气来满足生产菌的生理需求。工业发酵中的空气系统通常采用过滤法去除空气中的菌体、灰尘和水分等。实验室中的超净工作台和超净室也是通过空气过滤系统送入无菌空气。

3.紫外线灭菌

辐射是能量通过空气或外层空间传播、传递的一种物理现象。借助原子或亚原子离子高速运动传播能量的称微粒辐射，其中对微生物杀菌力强的为β射线和α射线。借助波动方式传播能量的称为电磁辐射，对微生物杀菌、抑菌力强的有紫外线和y射线。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，芽孢以及霉菌孢子对紫外线抵抗能力稍强。一般打开紫外线灯照射20～30min即可满足灭菌要求。为了加强灭菌效果，在开紫外线灯前，可在灭菌室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落;另一方面也可杀死一部分细菌和芽孢。

4.化学药物消毒与灭菌

化学药物根据其抑菌或杀死微生物的效应分为杀菌剂、消毒剂、防腐剂三类。凡杀死一切微生物及其孢子的药物称杀菌剂;只杀死感染性病原微生物的药剂称消毒剂;而只能抑制微生物生长和繁殖的药剂称为防腐剂。但三者界限往往很难区分，化学药剂的效应与药剂浓度、处理时间长短和菌的敏感性等均有关系，主要仍取决于药剂浓度，大多数杀菌剂在低浓度下只起抑菌作用或消毒作用。

化学药物适于生产车间环境的灭菌、接种操作前小型器具的灭菌等。化学药物的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。下面介绍常用的化学灭菌药剂。

(1)高锰酸钾

高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.10%～0.25%的溶液。

(2）漂白粉

主要成分是次氯酸钙，是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌剂。漂白粉含有效氯为28~35%。0.5~1.0%的漂白粉水溶液在5min内可杀死大多数细菌。5%漂白粉水溶液在1h内可杀死细菌的芽孢。

(3）乙醇

乙醇的杀菌机理是它的脱水作用、溶解细胞膜脂和进入蛋白质的肽键空间结构，引起蛋白质变性。乙醇消毒的最佳浓度是70~75%。乙醇对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差，主要用于物体表面和皮肤的消毒。

5．熏蒸消毒

(1)甲醛熏蒸消毒法

甲醛是强还原剂，其杀菌机理是破坏蛋白质的氢键，并与氨基结合，从而造成蛋白质变性。它的杀菌效果较好，对营养体和孢子都有作用。甲醛灭菌的缺点是穿透力差。工厂和实验室常采用甲醛熏蒸进行空间消毒。熏蒸的要求是空间的甲醛浓度达到6g/m3，熏8~12h。甲醛熏蒸对人的眼、鼻有强烈刺激，在相当时间内不能入室工作，为减弱甲醛对人的刺激作用，甲醛熏蒸后12h，再量取与甲醛等量的氨水，迅速放于室内与之中和。

(2）硫黄熏蒸法

利用硫黄燃烧产生SO2，后者遇水或水蒸气产生 H2SO3。SO2和H2 SO3还原能力强，使菌体脱氧而致死，可用于接种室或培养室空气的熏蒸灭菌。硫黄用量一般为2～3g/m3。为了防止H2SO3，和H2SO4，对金属腐蚀，熏蒸前应将金属制品妥善处理。